DEVELOPPEMENT D'APPROCHES PREDICTIVES POUR L'INGENIERIE DES PROTEINES PAR EVOLUTION DIRIGEE ET APPLICATION AU DEVELOPPEMENT D'UNE THERAPIE ANTICANCEREUSE

Overview & Synopsis

Le souhait de réduire des effets secondaires associés aux anticancéreux a mené à considérer l'utilisation de prodrogues activables au site d'action, comme la cyclophosphamide (CPA). La CPA est activée majoritairement par le CYP2B6 humain avec une faible efficacité, obligeant à l'utilisation de concentrations importantes de prodrogue. Celles-ci peuvent être réduites par transfection au niveau de la tumeur d'un gène codant pour un P450 optimisé, possédant une efficacité catalytique élevée vis-à-vis de la CPA tout en étant le moins immunogène possible. Pour ce faire, en partant de la modélisation du CYP2B6 et du CYP2B11, forme canine à bas Km pour l'activation de la CPA, un gène synthétique du CYP2B11 pour l'expression dans la levure a été dessiné et divisé en 15 "modules" structuraux. Quinze chimères à points de jonction définis entre les deux CYP2Bs ont ensuite été construites par échange de ces modules, via une méthode originale de génération de banques ordonnées de chimères, SIGNAL, indépendante de l'homologie de séquence des enzymes parentaux. SIGNAL, à mi-chemin entre les processus classiques d'évolution dirigée et de mutagenèse dirigée, nous a permis, après analyse fonctionnelle des chimères, de mieux comprendre le mécanisme de métabolisation de la CPA par les deux enzymes et d'identifier des modules structuraux jouant potentiellement un rôle important dans la haute affinité du CYP2B11. En parallèle, la mise au point d'un système de sélection à haut débit des variants les plus efficaces pour l'activation de la CPA dans la levure, basé sur le principe du gène rapporteur, a été débutée, afin de pouvoir raffiner l'optimisation du P450 par un processus de mutagenèse aléatoire.